BACKGROUND: Nuclear introns in Euglenida have been understudied. This study aimed to investigate nuclear introns in Euglenida by identifying a large number of introns in Euglena gracilis (E. gracilis), including cis-spliced conventional and nonconventional introns, as well as trans-spliced outrons. We also examined the sequence characteristics of these introns.
RESULTS: A total of 28,337 introns and 11,921 outrons were identified. Conventional and nonconventional introns have distinct splice site features; the former harbour canonical GT/C-AG splice sites, whereas the latter are capable of forming structured motifs with their terminal sequences. We observed that short introns had a preference for canonical GT-AG introns. Notably, conventional introns and outrons in E. gracilis exhibited a distinct cytidine-rich polypyrimidine tract, in contrast to the thymidine-rich tracts observed in other organisms. Furthermore, the SL-RNAs in E. gracilis, as well as in other trans-splicing species, can form a recently discovered motif called the extended U6/5\' ss duplex with the respective U6s. We also describe a novel type of alternative splicing pattern in E. gracilis. The tandem repeat sequences of introns in this protist were determined, and their contents were comparable to those in humans.
CONCLUSIONS: Our findings highlight the unique features of E. gracilis introns and provide insights into the splicing mechanism of these introns, as well as the genomics and evolution of Euglenida.

The parasitic flatworm Opisthorchis felineus is one of the causative agents of opisthorchiasis in humans. Recently, we assembled the O. felineus genome, but the correct genome annotation by means of standard methods was hampered by the presence of spliced leader trans-splicing (SLTS). As a result of SLTS, the original 5\'-end (outron) of the transcripts is replaced by a short spliced leader sequence donated from a specialized SL RNA. SLTS is involved in the RNA processing of more than half of O. felineus genes, making it hard to determine the structure of outrons and bona fide transcription start sites of the corresponding genes and operons, being based solely on mRNA-seq data. In the current study, we tested various experimental approaches for identifying the sequences of outrons in O. felineus using massive parallel sequencing. Two of them were developed by us for targeted sequencing of already processed branched outrons. One was based on sequence-specific reverse transcription from the SL intron toward the 5\'-end of the Y-branched outron. The other used outron hybridization with an immobilized single-stranded DNA probe complementary to the SL intron. Additionally, two approaches to the sequencing of rRNA-depleted total RNA were used, allowing the identification of a wider range of transcripts compared to mRNAseq. One is based on the enzymatic elimination of overrepresented cDNAs, the other utilizes exonucleolytic degradation of uncapped RNA by Terminator enzyme. By using the outron-targeting methods, we were not able to obtain the enrichment of RNA preparations by processed outrons, which is most likely indicative of a rapid turnover of these trans-splicing intermediate products. Of the two rRNA depletion methods, a method based on the enzymatic normalization of cDNA (Zymo-Seq RiboFree) showed high efficiency. Compared to mRNA-seq, it provides an approximately twofold increase in the fraction of reads originating from outrons and introns. The results suggest that unprocessed nascent transcripts are the main source of outron sequences in the RNA pool of O. felineus.
Opisthorchis felineus – представитель паразитических плоских червей, один из возбудителей описторхоза человека. Недавно нами была проведена сборка генома O. felineus, однако корректная аннотация генов в этом геноме стандартными методами оказалась затруднена наличием сплайс-лидер зависимого транс-сплайсинга (SLTS). В результате SLTS исходный 5’-конец (аутрон) транскриптов заменяется короткой сплайс-лидерной последовательностью, донором которой выступает специализированная молекула SL РНК. SLTS вовлечен в процессинг РНК более половины всех генов O. felineus, из-за чего становится невозможным установить последовательности аутронов и реальные старты транскрипции соответствующих генов и оперонов, опираясь только на данные mRNA-seq. В настоящей работе мы провели апробацию различных экспериментальных подходов для идентификации последовательностей аутронов у O. felineus с помощью массового параллельного секвенирования. Два подхода были спланированы нами для прицельного секвенирования процессированных разветвленных аутронов. Первый заключался в сиквенс-специфичной обратной транскрипции с SL-интрона в направлении 5’-конца аутрона. Во втором использовалась гибридизация аутронов с иммобилизованным одноцепочечным ДНК-зондом, комплементарным SL-интрону. Также были использованы два подхода к секвенированию тотальной РНК, обедненной по рРНК, позволяющих идентифицировать более широкий спектр транскриптов, чем mRNA-seq. Один из них основан на ферментативной элиминации перепредставленных кДНК, другой – на ферментативной деградации некэпированных РНК экзонуклеазой Terminator. С помощью селективных методов нам не удалось получить обогащения препаратов РНК по процессированным аутронам, что, наиболее вероятно, связано с коротким временем жизни этих промежуточных продуктов транс-сплайсинга. Из двух методов обеднения по рРНК высокую эффективность показал метод, основанный на ферментативной нормализации кДНК (Zymo-Seq RiboFree). Он позволил примерно вдвое увеличить долю прочтений, соответствующих аутронам и интронам, по сравнению с mRNA-seq. Полученные результаты предполагают, что основным ресурсом последовательностей аутронов в пуле РНК O. felineus служат новосинтезированные непроцессированные транскрипты.